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免疫共沉淀的具体注意事项
发布日期:2014-08-26 10:17

 免疫共沉淀 

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 
 
其优点为: 
1.  相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
2.  蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
3.  可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为: 
1.  可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
2.  两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
3.  必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:
1.  转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;
2.  取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
3.  取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
4.  将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
5.  免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;
6.  SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:
1.  细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。
2.  使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用
3.  使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
1.  确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
2.  要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
3.  确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

二、ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢:
1.  显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。
2.  超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白。 

三、ChIP是ChIp(染色质免疫沉淀),不是楼主说的Co-IP(免疫共沉淀),二者是风马牛不相及的两个试验和概念,原理和目的都不一样,楼上很多人将二者搞混了。染色质免疫沉淀的作用是鉴定蛋白与DNA的结合,相当于EMSA(凝胶滞留试验)的体内试验。
基本原理是用抗体将目标蛋白及其它可能结合的DNA沉淀下来,然后用引物扩增DNA的序列。因此这个目标蛋白通常具备转录调节功能,能够结合DNA,目前也有做结合RNA的Chip。免疫共沉淀的作用是鉴定蛋白与蛋白的相互作用。用抗体将蛋白(A)及其可能结合的目标蛋白(B)沉淀下来。因此这个A蛋白可以是任何蛋白。“共”指反过来用B的抗体也能将A/B复合物沉下来。如果是单向的,通常叫免疫沉淀。

四、我做的不是很多,但是有几点提出来和大家讨论下。我想这个试验最关键的就是细胞的处理和抗体来源。如以上所说,的确很多WB的抗体是不一定可以用到ChIP上的,这个应该是和抗体的制作过程有关系的。至于多抗还是单抗,我认为各有优缺点。比如说单抗是特异性的针对某种表位的,这样可以选择几种单抗混合使用效果会好些,而且背景也低很多。多抗虽然比较复杂,最主要的是非特异性反应比较多,导致试验结果不好判断,但是经过合理的纯化,应该会将这个缺点变小。做ChIP的抗体应该是能够针对空间表位的,虽然某些针对线性表位的抗体也能够运用其中,但是那只是小部分,所以我认为抗体的来源很关键,无论是购买还是自己制作,都需要对其的特性比较了解。

ChIP还有一个问题是细胞的处理,虽然很多公司都提供了现成的试剂可供选择,但是那只是通用性的试剂,真正适合自己细胞的还需要做预试验摸索下。其次是细胞内相互作用的蛋白,可能会由于处理导致不发生作用等等因素导致相应值变低,所以我觉得处理时间,温度等等外部条件还是很重要的。以上是个人观点,仅供参考!
五、目前个人认为生物医学研究的瓶颈就是是否能制备高质量的适合多种用途的抗体。很多所谓的主流研究方法都要依赖抗体。例如Western blot,免疫荧光,流式分析,ELISA,IP,CoIP, ChIP。个人对抗体制备的原理和方法不是很清楚,但是实际过程中很多并不想说明书上说的那样,结果是否漂亮,只有用了才知道。Western blot应该是抗体的最基本功能,他的最后原理是抗体结合到膜上的抗原,然后通过二抗来显示其位置。免疫共沉淀的抗体就不一样了,他要保证能够将你的目标蛋白及其复合物牢固的结合并通过蛋白A或G将其沉下来。

举个简单的例子说明二者的不同,不知道是否正确,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在床上(膜)可能很容易办到,上述过程类似WB,抗体的功能只是识别固定物(转膜)上的抗原,风平浪静。相反,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在激流中就不容易办到,上述过程类似免疫沉淀,是动态环境下的识别,而且必须特异性的牢固结合,这种接吻要求是热吻,紧密结合,并且最终用一个钩子(免疫沉淀中叫蛋白A或G)将男的勾下来后,要保证男的还热吻者那个女的(即抗原)。因此要求这个男的(抗体)要紧紧的抱住那个女的(抗原)。可想而知激流中(免疫沉淀)对男的质量要求更高,一定要保证不与女的分手。如果男的还三心二意,可能抱的是其他的女人,这在免疫沉淀中就会产生非特异性条带。因此,免疫沉淀一定要设置对照IG抗体来沉淀,如果随便一个男的(对照IG)也能将某个女的抱下来,那这个女的就是“博爱”,不是真正需要的最爱(特异条带)。鉴于目前很多男的(抗体)质量不可靠或者不能满足,因此大量的文献喜欢采用标签蛋白(例如,HIS,HA,GFP,MYC等)作为“特异男”来勾引“女”的。
个人认为需要一个个试,看那个能够用于免疫沉淀,有的抗体是针对男的“嘴巴”来设计的,这种抗体当然能够容易将女的抱下来,相反有的是针对其他部位设计制备抗体的,功能也就不一样了。Co-Ip成功的关键主要有两个:1)男的质量。2)男女接吻时的环境(例如是否有其他干扰因素,沉淀的时间,温度,比例,旋转强度等)
不对指正。

六、想说下免疫沉淀,免疫沉淀是用你的抗体富集目的抗原,然后用WESTERN显示,你的抗体是否结合抗原。由于是富集了目的抗原,WESTERN不容易做出来的,用免疫沉淀可能容易出结果,但是也容易出杂带。如果看两个分子是否相互作用,可以用免疫共沉淀。
染色质免疫沉淀(EMSA)主要用于研究转录因子的。实验技巧是为了实验目的服务的,撇开实验目的,单纯讨论实验技巧,似不可取。另外建议:发现很多战友发贴,不注明实验目的,这样讨论,可能最后发现所讨论的实验技术并不是为你的实验目的服务的。

七、关于抗体的问题,我的看法是:
1.  对应WB而言,使用的抗体识别的抗原应该是线性化的抗原(SDS)的作用,因此它识别的不是蛋白在具有正常空间结构时的抗原决定簇,而是在蛋白一级结构上相临的几个AA组成的抗原决定簇。
2.  对应FACS而言,多数情况下,它识别的是具有正常高级结构的蛋白的抗原决定簇,这些抗原决定簇可能是由相邻近的AA组成的或者是由于蛋白折叠后原本在一级结构上相距比较远的几个AA组成的,因此WB和FACS的抗体有时能够通用,有时不能通用。
3.  Co-IP的情况,我认为和FACS是相类似的。
4.  ChIP的情况最为头痛,因为它涉及了一个crosslink的过程,这个可能造成一些抗原决定簇被封闭掉,而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些变性剂,进一步影响了抗原抗体的结合,因此WB可以用的抗体并不一定能用于ChIP,按照现在的说法,如果不是被validated过的抗体,做ChIP可能需要对多个抗体进行优化评估灵敏性和特异性。

至于是固相杂交还是液像杂交我觉得到不是重点,事实上,和固态的蛋白芯片相比较,液态蛋白芯片(luminex)的效率更高,因为抗原抗体有更加充分的机会接触。

八、 我想说的是不管是co-IP还是ChIP,一定要有阴性control,也就是和一抗相同来源的normal IgG。因为珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA,包括一些抗原抗体的非特异性结合,所以很多时候阴性control和实验组时间是量的差别,而不是有或无的关系。

九、建议:
1.  有一种免疫沉淀的方案是有“radioactivesupernatant”,我们一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的,看具体的实验目的了。
2.  santa cruz的抗体写了可以做IP,但是出厂不检验,看你的运气了,要多摸索条件。
3.  你的抗原是在细胞膜上还是在细胞核上,可根据情况选择裂解液。
4.  免疫沉淀的结果最好同时有WESTERN对照,这样可以知道是否成功沉淀了特异性条带。免疫沉淀本身还有个阴性对照。
5.  实验注意低温,操作细心。

十、 再次有问请教这里的前辈,我把IP下来的蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后进行WESTERN BLOT 或者考马斯亮蓝染色,WESTERN BOT可以明显看到我用于沉淀的蛋白,灰度几乎和抗体的重链差不多,可是考染的结果却只能看到重链和轻连,银染也是这样子,这可怎么办呢?我的目的就是要比较沉下来的东西有什么差别。沉下来的东西直接进行质谱鉴定应该怎么处理呢?如果你的蛋白和IgG的分子量差不多,则需要制作标签融合蛋白,以方便洗脱IgG和beads。
具体如下:
1.  制作含标签(如myc)的目的蛋白克隆载体。
2.  用含anti-myc的beads,pull-down目的蛋白。
3.  最后洗的时候,要有一次用myc的peptide洗脱液进行洗脱beads和anti-myc。
4.  这时上清就只含有你的目的蛋白,而去除了IgG.
四川省科学技术厅 主办
成都市学道街39号 邮编: 610016
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