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小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定
发布日期:2014-08-26 10:15

 摘要: 胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化等特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。本方法主要介绍小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定流程。 

 实验概要
本方法主要介绍小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定流程。

主要试剂
高糖DMEM(Gibco,cat NO:12800-017粉末)、DMEM/F12(Gibco,cat NO:12500-062粉末)、胎牛血清(FBS)(Gibco,cat NO:16000044)
非必需氨基酸(NEAA)(Gibco,cat NO:11140050)、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid(Gibco,cat NO:25200072)、明胶(BD,cat NO:354277)、青链霉素(SP)(Gibco,cat NO:15140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO:25030081)、血清替代物(Gibco,cat NO:10829028)
10%FBS培养液(Gibco , cat NO.10099141)

主要设备
1、超净台
2、CO2培养箱(Thermo , cat NO.3131)
3、6cm培养皿(corning , cat NO.430166)、10cm培养皿(corning , cat NO.430167)
4、15ml离心管(corning , cat NO.430791)、50ml离心管(corning , cat NO.430829)、冻存管(corning , cat NO.430659)
5、正置显微镜 

实验步骤
①常规方法消化细胞,吹打时用粗口滴管,只吹打成细胞团块;
②将细胞团块移至6 cm或10 cm培养皿中,改用含10%FBS的培养液培养(每个6 cm培养皿加5 ml培养液);
③将培养皿放入37℃CO2培养箱培养,每天取出1-2次,轻轻晃动或用粗口滴管吹打,使细胞悬浮,各团分开,并逐日观察;
④一般培养第3天细胞团开始分层,外部是一层较大的内胚层样细胞,内部的细胞则小而紧密,为外胚层样细胞和干细胞,此为简单类胚;再培养5-10天,分层增多,并出现空腔,整个胚呈圆泡状,此为囊状胚。
⑤收集囊状胚,提取mRNA,反转录为cDNA,然后使用三胚层的引物进行PCR来检测三胚层的基因的表达情况,从而确定囊状胚中是否有三胚层的分化,这样可以确定细胞是否具有在体外分化为三胚层细胞的能力。

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成都市学道街39号 邮编: 610016
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